Øvelsesvejledning: DNA-ekstraktion fra Kiwi
Formål: At isolere DNA fra planteceller (kiwi) og gøre det synligt med det blotte øje ved hjælp af simpel kemi.
Teori
For at få DNA'et ud af cellerne skal vi overvinde tre forhindringer:
- Cellevæggen: Kiwien er en plante, og planteceller er omgivet af en hård cellevæg af cellulose. Denne skal nedbrydes mekanisk (ved at mose frugten).
- Membranerne: Både selve cellen og cellekernen (hvor DNA'et ligger) er omgivet af membraner lavet af fedtstoffer (lipider). Opvaskemiddel indeholder tensider, der opløser fedt – præcis ligesom når man vasker en fedtet stegepande. Sæben "lukker cellen op".
[Image of cell membrane phospholipid bilayer structure]
- Proteiner og enzymer: DNA er rullet op omkring proteiner (histoner). Salt hjælper med at frigøre DNA'et fra proteinerne. Samtidig indeholder cellen enzymer (DNase), der normalt "klipper" fremmed DNA i stykker. Ved at holde blandingen iskold sænker vi disse enzymers aktivitet, så de ikke ødelægger vores DNA, før vi når at se det.
Hvorfor sprit? DNA elsker vand (det er opløseligt i vand), men det hader alkohol. Når vi tilsætter iskold ethanol, kan DNA'et ikke længere være opløst. Det fælder ud (præcipiterer) og bliver synligt som hvide, slimede tråde i grænselaget mellem vand og sprit.
Materialer
- 1/2 Kiwi (eller jordbær/løg)
- Opvaskemiddel (uden parfume er bedst)
- Salt (NaCl)
- Iskold Ethanol / Husholdningssprit (93-99%)
- Vand
- Morter og pistil (eller en gaffel og en skål)
- 2 bægerglas (ca. 100-250 ml)
- Tragt og Kaffefilter/Gaze
- Teske
- Træpind / Engangspipette
- Isbad (skål med isterninger)
VIGTIGT: Spritten skal være iskold (fra fryseren) for det bedste resultat!
Fremgangsmåde
- Klargør "Ekstraktions-buffer": I et lille bægerglas blandes:
- 50 ml vand
- 1 teskefuld opvaskemiddel
- 1 teskefuld salt
Rør forsigtigt rundt for at opløse saltet uden at lave for meget skum. Sæt blandingen i isbadet.
- Nedbryd cellevægge: Skræl kiwien og skær den i mindre stykker. Mos den grundigt i morteren (eller med en gaffel). Jo færre klumper, jo bedre.
- Bland: Hæld din kiwi-mos ned i bægerglasset med den kolde ekstraktions-buffer (vand/sæbe/salt). Rør forsigtigt rundt.
- Inkubering: Lad blandingen stå i isbadet i ca. 5-10 minutter. (Her opløser sæben fedtmembranerne, og kulden bremser enzymerne).
- Filtrering: Sæt tragten med kaffefilteret i et rent bægerglas (eller et højt måleglas). Hæld kiwi-suppen igennem filteret. Vi skal bruge væsken (filtratet), ikke snasket i filteret.
- DNA-fældning (Det kritiske punkt!):
- Mål ca. hvor meget kiwi-saft du har (fx 20 ml).
- Hæld forsigtigt en tilsvarende mængde iskold sprit ned langs indersiden af glasset.
- Hold glasset på skrå, så spritten lægger sig som et "låg" ovenpå saften. DU MÅ IKKE RØRE RUNDT!
- Observation: Kig på grænsefladen mellem den grønne saft og den klare sprit. Efter lidt tid vil hvide, slimede tråde/skyer stige op i spritten. Det er DNA!
- Opsamling: Prøv forsigtigt at "fiske" DNA'et op med en træpind ved at dreje pinden rundt i slimet.
Resultatbehandling
Tag et billede af dit glas, hvor man tydeligt kan se de to lag og DNA'et. Indsæt billedet i din journal.
Diskussion (til Journal)
Besvar følgende spørgsmål i din journal/rapport:
- Hvad er det, vi fysisk har ødelagt ved at mose kiwien? (Hint: Planteceller vs. dyreceller).
- Hvilken kemisk egenskab har opvaskemiddel, som gør det i stand til at ødelægge cellemembranen? (Sammenlign evt. med fedt på en tallerken).
- Hvorfor var det vigtigt, at spritten var iskold?
- Celler indeholder enzymet DNase, som nedbryder DNA.
- Hvorfor indeholder celler overhovedet noget, der kan ødelægge deres eget DNA? (Hint: Tænk på virusforsvar eller celledød).
- Hvorfor ødelægger DNase ikke cellens DNA, mens kiwien stadig er levende og hænger på træet? (Hint: Cellen er opdelt i rum/organeller).
- Hvis du skulle lave forsøget med dine egne celler (mundskrab), hvilket trin i fremgangsmåden kunne du så springe over? Hvorfor?